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本试剂盒适用于快速提取微量动物细胞、微切割组织和易裂解动物组织等样品总RNA，使用特别的基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，不需要使用DNase消化，RNA可直接用于PCR，荧光定量PCR。独特的裂解液迅速裂解微量样品的细胞和灭活细胞RNA酶，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于特制离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free H20将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

• 完全不使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
  
• 快速，简捷，单个样品操作一般可在30分钟内完成。
  
• 独特研发成功基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于PCR、荧光定量PCR等实验。
  
• 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.9～2.0，基本无DNA残留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

组分	规格
裂解液RLT Plus	20mL
去蛋白液RW1	40mL
漂洗液RW	10mL
RNase-free H2O	10mL
70%乙醇	9mL
Poly Carrier	200μL
基因组DNA清除柱和收集管	50套
RNase-free吸附柱RA和收集管	50套
微量研磨杵	3根

保存：室温，有效期9个月。Poly Carrier 4℃可保存一个月，-20℃可保存一年。

• 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
  
• 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15℃～25℃)进行。
  
• 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

• 漂洗液RW第一次使用前加入42mL无水乙醇。
  
• 70%乙醇瓶里是9mL的RNase-free H2O，第一次使用前加入21mL无水乙醇。
  
• 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
  
• 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。如细胞处理量不超过5×10⁵，组织不超过5mg。
  
• 一般本试剂盒最小处理量可以处理10个以上的组织细胞。
  
• 裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
  
• Poly Carrier使用方法：如果其实处理量很少，我们推荐使用Poly Carrier，如果预期有较大DNA产量，用户可根据需要选择是否加入Poly Carrier。使用时每个样品提取所需裂解液RLT Plus中加入4μL Poly Carrier，将裂解液RLT Plus与Poly Carrier溶液充分颠倒混匀即可。也可根据样品数量，在总共需要的裂解液RLT Plus中加入总共需要的Poly Carrier混匀备用，混合液室温24小时内稳定。
  
• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  • 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
    
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。
    
  • RNA在裂解液RLT Plus中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。)
• 关于DNA的微量残留：
  一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留)，本公司的RNAspin Plus RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：
  
  • 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
    
  • 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
    
  • 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理以提高效果。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(cleanup)，请联系我们索取具体操作说明书。
    
  • 在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。

提示：

• 实验前请先阅读注意事项
  
• 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
  
• 如果处理的细胞量小于5000个或者处理组织量小于10μg时，匀浆前请在裂解液中加入4μL Poly Carrier(按照注意事项6)

• 组织培养细胞
  
  • 收集<5×10⁵悬浮细胞到一个1.5mL离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
    
  • 13000rpm离心10秒(或者300g离心5分钟)，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
    
  • 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加350μL (<5×10⁵细胞)裂解液RLT Plus，吹打混匀后用手剧烈振荡20秒充分裂解。
    
  • 匀浆：(处理细胞量极少时<1×10⁵一般不需要，涡旋振荡一分钟匀浆)。用带钝针头的一次性1mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物5～10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
    
  • 将裂解混合物或匀浆混合物全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
    
  • 接操作步骤项下3。
• 动物组织(例如鼠肝脑)
  
  • 电动匀浆：<5mg组织加入350μL裂解液RLT Plus后电动彻底匀浆20～40秒。
    
  • 研磨杵+匀浆：1.5mL离心管内，加入100μL裂解液RLT Plus，加入<5mg组织立刻用微量研磨杵研磨匀浆完全。补足裂解液RLT Plus到350μL。用带钝针头的一次性1mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度防堵塞柱子和提高产量。
    
  • 液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(<5mg)转入装有350μL组织裂解液RLT Plus的1.5mL离心管中，用手剧烈振荡20秒，充分裂解。用带钝针头的一次性1mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物10次或直到
    得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，防堵塞柱子和提高产量。
    
  • 将匀浆后裂解物13000rpm离心3分钟，沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物，将裂解物上清全部加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。
    
  • 接操作步骤项下3。
• 13000rpm离心30秒，保留滤过液(RNA在滤过液中)。
  
• 用微量移液器较精确估计滤过液体积(通常为350μL，滤过时候损失体积应该减去)，加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
  
• 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加700μL去蛋白液RW1，室温放置1分钟，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
  
• 加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复一遍。
  
• 将吸附柱RA放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  
• 取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加15-20μlRNase free water(事先在70～90℃水浴中加热可提高产量)，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟。减少洗脱体积可以提高RNA浓度，但是RNA产量会降低，用户根据需要选择。

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